Lipid peroxidation and the antioxidant system of the lungs during hyperbaric oxidation and its aftereffect: prospective study

Full Text

Введение. В настоящее время гипербарическая оксигенация (ГБО) применяется не только для борьбы с гипоксическими состояниями организма [1, 2], но и для повышения работоспособности спортсменов [3] и военнослужащих [4, 5]. Однако широкое внедрение ГБО в спортивную и реабилитационную медицину сдерживается существующим в настоящее время предубеждением о токсическом влиянии гипероксии на организм в результате способности гипербарического кислорода стимулировать перекисное окисление липидов (ПОЛ) и свободно-радикальные процессы [6, 7]. При этом не учитывается тот факт, что в большинстве случаев указанные эффекты получены при режимах ГБО, не применяемых в клинике [7]. Между тем влиянию лечебных режимов ГБО на свободно-радикальные процессы, ПОЛ и антиоксидантную систему здорового органа (организма), как и их изменениям в динамике ПГП, посвящены единичные исследования [8, 9].

Целью настоящего исследования явилось изучение состояния ПОЛ и антиоксидантной системы легочной ткани здорового организма при однократном и многократном применении ГБО в терапевтическом режиме и динамики этих изменений в ПГП.

Материал и методы. Исследования проведены на 100 беспородных белых крысах массой 170–220 г в экспериментальной лаборатории кафедры нормальной физиологии (зав. – проф. В.Н. Яковлев) Воронежской государственной медицинской академии им. Н.Н. Бурденко. Гипербарическую оксигенацию осуществляли медицинским кислородом (ГОСТ 5583-50, чистота не менее 99,2%) в барокамере объемом 90 л, в которой находилась натронная известь («Пи-868, ГОСТ 4455-48), активированный уголь (ОЧ марки «Б» ГОСТ 4453) для поглощения СО₂ и других газообразных продуктов жизнедеятельности, а также селикагель марки «КСК» ГОСТ 3956-54 для поглощения водяных паров. Компрессию прекращали, создав давление в 2 ата (202,6 кПа). Скорость компрессии и декомпрессии 20,25 кПа/мин, длительность 5 мин. Время изопрессии (нахождения в барокамере при 2 ата) – 50 мин. Сеансы проводили в утренние часы по одному в сутки. Всего 5 сеансов на курс. Животные были распределены на 5 серий опытов: 1-я серия (контроль) – здоровые неоксигенированные животные (норма); 2-я серия – здоровые животные, исследованные сразу после однократного применения ГБО; 3-я серия – здоровые животные, исследованные на 5-е сутки после однократного сеанса ГБО (5-е сутки ПГП); 4-я серия – здоровые животные, исследованные сразу после пятого сеанса ГБО (1-е сутки ПГП); 5-я серия – здоровые животные, исследованные на 5-е сутки после окончания 5-дневного курса ГБО.

Животных заб ивали на фоне эфирного наркоза с учетом «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ МЗ СССР №755 от 12.08.1977). Объектом исследования служили легкие. После вскрытия грудной клетки выполняли декапитацию и перфузию легких (на льду) охлажденным до +1±3 ⁰С 0,9 % раствором NaCl в объеме 10 мл. Ткань легкого разделяли на две части. Одну гомогенизировали в 0,25 М растворе трис-HCl буфера при температуре +1±3 ⁰С. Другую экстрагировали в 17 % растворе трихлоруксусной кислоты при такой же температуре. Пробы центифугировали в течение 10 мин при 900 g. Надосадочную жидкость использовали для определения биохимических показателей. В легочной ткани определяли активность супероксиддисмутазы (СОД, КФ 1.15.1.11) хемилюминесцентным методом [10], активность каталазы – спектрофотометрически [11], содержание малонового диальдегида (МДА) – спектрофотометрическим методом с тиобарбитуровой кислотой [12]; внеэритроцитарного гемолглобина по Т.Н. Дарвило и Н.К. Бьянко [13]; мочевины – диацетилмоноксимовым методом [14]; мочевой кислоты – колориметрическим методом [15].

Результаты исследований обработаны статистически с использованием параметрического t-критерия Стьюдента и непараметрического критерия Манна–Уитни после предварительной проверки гипотезы о нормальности выборочного распределения. Статистический анализ выполняли с использованием пакетов Microsoft Exel, Statistica 5.0 Statsoft и Biostat.

Результаты. Как видно из табл. 1, концентрация внеэритроцитарного гемоглобина, являющегося катализатором образования свободных радикалов при токсических режимах гипероксии, в легочной ткани достоверно не изменялась как при гипероксии, так и в ПГП после однократного и пятикратного применения ГБО [16].

 

Таблица 1. Динамика содержания внеэритроцитарного гемоглобина (ВЭГ, мг/кг сырой ткани), и малонового диальдегида (МДА, мкмоль кг сырой ткани) (M ± m)

Table 1. Dynamics of the content of extraerythrocytic hemoglobin (VEG, mg/kg of raw tissue), and malondialdehyde (MDA, mmol kg of raw tissue) (M ± m)

Показатель	Норма (1-я серия)	1 сеанс ГБО		Курс из 5 сеансов ГБО
		1-е сутки ПГП (2-я серия)	5-е сутки ПГП (3-я серия)	1-е сутки ПГП (4-я серия)	5-е сутки ПГП (5-я серия)
ВЭГ	1,11 ± 0,16 n = 7	1,14 ± 0,09 n = 7	1,12 ± 0,13 n = 7	1,15 ± 0,09 n = 7	1,11 ± 0,2 n = 7
МДА	113,6 ± 14,9 n = 10	93,6 ± 7,8 n = 10	143,2±12,2▲ n = 10	179,6± 13,2*▲ n = 10	148,4±10,2▲▼ n = 10

Примечание. ПГП – постгипероксический период (после прекращения применения гипербарической оксигенации – ГБО); * p < 0,05 – достоверность различий по сравнению с нормой, ^▲ p < 0,05 – достоверность различий по сравнению с животными 2-й серии; ^▼р < 0,05 – достоверность различий по сравнению с животными 4-й серии; n – число животных по сериям опытов.

Note. ПГП – posthyperoxic period (after discontinuation of hyperbaric oxygenation – ГБО); * p < 0.05 – reliability of differences compared to the norm, ^▲ p < 0.05 – reliability of differences compared to animals of the 2nd series; ^▼ p < 0.05 - reliability of differences compared to animals of the 4th series; n – number animals according to a series of experiments.

 

Исследования содержания в легочной ткани МДА (табл. 1) не выявили достоверного различия его концентрации в легочной ткани как на 1-е, так и на 5-е сутки после однократного применения ГБО. Следовательно, сеанс ГБО в режиме 2 ата, 50 мин не оказывает непосредственного стимулирующего влияния на реакции ПОЛ легочной ткани, сопряженные с образованием МДА. Однако он повышает их чувствительность к многократному гипероксическому воздействию. Неслучайно прирост концентрации МДА в легочной ткани на 1-е сутки после окончания 5-дневного курса ГБО превышал аналогичный показатель животных 2-й серии на 92 %, тогда как норму – на 58 % (см. табл. 1). Можно предположить, что это вызвано отсроченной активацией ПОЛ легочной ткани как одного из механизмов формирования постгипероксического состояния организма, не выходящей за физиологические нормы. На это указывает отсутствие достоверного различия между концентрациями МДА у животных 1-й и 3-й серии опытов (см. табл. 1). В свою очередь, на 5-е сутки после окончания 5-дневного курса ГБО концентрация МДА в легочной ткани достоверно не отличалась как от нормы, так и по сравнению с аналогичными показателями животных 3-й и 4-й серии опытов. Однако по сравнению с животными 2-й серии была повышена на 59 % (см. табл. 1).

Сопоставление полученных результатов позволяет говорить о том, что 5-дневный курс в режиме 2 ата, 50 мин, 1 сеанс в сутки не вызывает неконтролируемого образования МДА как в процессе гипероксического воздействия, так и на 5-е сутки ПГП. Однократное применение ГБО повышает чувствительность МДА-образующих реакций ПОЛ к очередному гипероксическому воздействию, которая сохраняется после увеличения количества сеансов ГБО до пяти.

Как видно из табл. 2, однократный сеанс ГБО приводил к увеличению активности супероксиддисмутазы (СОД) легочной ткани на 1-е и 5-е сутки ПГП соответственно на 74 % и 83 %. Это указывает на сохранение стимулирующего эффекта однократного сеанса ГБО к 5-м суткам ПГП. При увеличении количества сеансов до 5 стимулирующий эффект ГБО на активность СОД прекращался (4-я серия). В результате она становилась достоверно сниженной по сравнению с аналогичными показателями животных 2-й и 3-й серий опытов, находясь в пределах нормы (табл. 2). Между тем через 5 сут после окончания 5-дневного курса ГБО (5-я серия) активность СОД в легочной ткани становилась на 62 % выше нормы и на 90 % выше аналогичного показателя животных 4-й серии опытов (см. табл. 2). Однако по сравнению с животными 3-й и 4-й серии опытов достоверного различия не было (см. табл. 2).

 

Таблица 2. Динамика активности супероксиддисмутазы (СОД, УЕ/г сырой ткани), каталазы (мкмоль/кг *мин), содержания мочевины (ммоль/кг сырой ткани), мочевой кислоты (мкмоль/кг сырой ткани) в легких крыс после 1 и 5 сеансов гипербарической оксигенации (M ± m)

Table 2. Dynamics of activity of superoxide dismutase (SOD, UE/g of raw tissue), catalase (mmol/kg *min), urea content (mmol/kg of raw tissue), uric acid (mmol/kg of raw tissue) in rat lungs after 1 and 5 sessions of hyperbaric oxygenation (I)

Показатель	Норма (1-я серия) n = 10	1 сеанс ГБО		Курс из 5 сеансов ГБО
		1-е сутки ПГП (2-я серия) n = 10	5-е сутки ПГП (3-я серия) n = 10	1-е сутки ПГП (4-я серия) n = 10	5-е сутки ПГП (5-я серия) n = 10
Каталаза	0,98 ± 0,06	1,75± 0,11*	1,12 ± 0,11▲	1,32 ± 0,14	1,55 ± 0,11*▼
СОД	638,3 ± 44,2	1110,6±75,8*	1168 ± 56,4*	544,6±31,4 ▲▼	1034,0±55,1*●
Мочевина	4,37 ± 0,28	8,01 ± 0,45*	7,01 ± 0,51*	6,86 ± 0,22*	5,90 ± 0,18*●▲
МК	170,3± 16,2	388,3 ± 38,8*	200,4±18,3▲	333,6± 31,4*▼	198,6±14,6●

Примечание. ВЭГ– внеэритроцитарный гемоглобин; ГБО – гипербарическая оксигенация, МК – мочевая кислота, ПГП – постгипероксический период (после прекращения окончания применения ГБО); *p < 0,05 – достоверность различий по сравнению с нормой, ^▲ p < 0,05 – достоверность различий по сравнению с животными 2-й серии; ^▼ р < 0,05 – достоверность различий по сравнению с животными 3-й серии ; ^●р < 0,05 – достоверность различий по сравнению с животными 4-й серии; n – число животных по сериям опытов

Note. ВЭГ– extraerythrocytic hemoglobin; ГБО – hyperbaric oxygenation, MК – uric acid, PGP – posthyperoxic period (after the termination of the end of the use of ГБО); *p < 0.05 – the reliability of differences compared with the norm, ^▲ p < 0.05 – the reliability of differences compared with animals of the 2^nd series; ^▼ p < 0.05 – the reliability of differences compared to animals of the 3rd series; ^● p < 0.05 – the reliability of differences compared to animals of the 4th series; n – the number of animals according to the series of experiments

 

Сопоставление полученных результатов позволяет говорить о том, что при увеличении количества сеансов ГБО с одного до пяти развивается рефрактерность СОД легочной ткани к гипероксическому воздействию, что проявляется нормализацией повышенной активности фермента. Прекращение 5-дневного курса ГБО вызывает отсроченную активацию СОД к 5-м суткам ПГП, степень прироста которой не отличается от аналогичных изменений активности фермента, выявленных в легочной ткани здоровых крыс на 1-е и 5-е сутки после однократного применения ГБО.

Как видно из табл. 2, активность каталазы в легких на 1-е сутки после однократного применения ГБО превышала норму на 79 %, достоверно не отличалась от нее сразу после сеанса. При увеличении количества сеансов ГБО до пяти стимулирующее влияние гипероксии на каталазу легких прекращалось, в результате на 1-е сутки после окончания курса ГБО (4-я серия) она достоверно не отличалась от нормы (см. табл. 2). Однако на 5-е сутки после отмены курса ГБО активность каталазы в легких достоверно превышала норму и аналогичный показатель 3-й серии опытов соответственно на 58 % и 38 % (см. табл. 2). Следовательно, увеличение количества сеансов ГБО до пяти приводит к рефрактерности каталазы легочной ткани, к стимулирующему влиянию гипероксии, что проявляется нормализацией активности фермента. Одновременно с этим формируются условия для отсроченной стимуляции активности каталазы в легких на 5-е сутки ПГП, отсутствующие после однократного применения ГБО.

Как видно из табл. 2, содержание в легких мочевины, являющейся эндогенным антиоксидантом [16], достоверно увеличивалось не только на 1-е сутки после однократного и пятикратного применения ГБО, но на 5-е сутки ПГП (см. табл. 2). Только на 5-е сутки после окончания курса ГБО концентрация мочевины в легких хотя и превышала норму на 35 %, но была достоверно снижена относительно первых суток ПГП после 1-го и 5-го сеансов ГБО соответственно на 26 % и 14 % (см. табл. 2). Из этого следует, что накопление мочевины легочной тканью в процессе 5-дневного курса ГБО не зависит от количества сеансов. Однако увеличение количества сеансов с одного до пяти ограничивают способность легочной ткани к накоплению мочевины после окончания гипероксического воздействия.

В отличие о мочевины, другой эндогенный антиоксидант – мочевая кислота – накапливалась в легочной ткани только при гипероксическом воздействии. В результате ее концентрации в легких в 1-е сутки ПГП при однократном и пятикратном применении ГБО превышала нормы соответственно на 128 % и 95 % (см. табл. 2). На 5-е сутки после 1-го и 5-го сеансов ГБО концентрация мочевой кислоты в легких снижалась по сравнению с аналогичным показателем животных 2-й и 4-й серии опытов соответственно на 48 % и 40 % до нормальных величин (см. табл. 2). Следовательно, накопление мочевой кислоты легочной тканью в процессе 5-дневного курса ГБО является ответной реакцией ее клеток на сверхнасыщение их кислородом. Она прекращается после завершения сеанса ГБО, сопровождаясь нормализацией концентрации метаболита в легочной ткани. Увеличение количества сеансов ГБО от одного до пяти не влияет на количество мочевой кислоты, накапливаемой в легочной ткани при гипероксии

Обсуждение. Сопоставление полученных результатов показывает, что выбранный нами режим ГБО (2 ата, 50 мин, 1 сеанс в сутки) при 5-дневном курсовом применении не приводит к накоплению в легочной ткани внеэритроцитарного гемоглобина и не вызывает стойкого накопления в ней МДА – одного из вторичных продуктов ПОЛ. Известно, что МДА образуется в процессе деградации полиненасыщенных жирных кислот активными формами кислорода. Поэтому есть все основания говорить об ограничении повышенного образования последних как во время гипероксического воздействия, так и на 5-е сутки ПГП. Одним из механизмов биологического эффекта гипербарического кислорода является обнаруженная нами стимуляция в легких активности СОД (см. табл. 2), катализирующей реакцию нейтрализации супероксидного аниона кислорода – О₂^- [17]. Не случайно накопление в легочной ткани МДА происходило на фоне нормализации активности СОД (см. табл. 2). Обнаруженное нами увеличение МДА в динамике ПГП после однократного сеанса ГБО, происходящее в пределах границ нормы (см. табл. 1), мы трактуем как результат естественных перестроек реакций ПОЛ, возникающих в оксигенированном организме при формировании постгипероксического состояния. Последнее представляет собой совокупность функционально-метаболических и морфогенетических изменений, возникающих в организме в процессе адаптации к гипербарическому кислороду и изменяющих его саногенный потенциал [18]. С этих позиций объясняется повышение активности каталазы и СОД на 5-е сутки после завершения курса ГБО.

В процессе дисмутации О₂^- при участии СОД образуется менее реакционно-способная молекула перекиси водорода [17], которая, в свою очередь, подвергается разложению с участием каталазы [19]. Поэтому активацию каталазы на 1-е сутки после одного сеанса ГБО и на 5-е сутки после прекращения 5-дневного курса ГБО, происходящие на фоне повышения активности СОД, можно рассматривать как реакцию на повышенное образование перекиси водорода, в том числе в реакции дисмутации О₂^-. Есть все основания утверждать, что нормализация образования перекиси в легочной ткани является причиной прекращения стимулирующего влияния гипероксии на каталазу при увеличении количества сеансов ГБО до пяти. Это позволяет говорить о формировании гипероксического типа рефрактерности, который формируется либо при увеличении времени нахождения в условиях гипероксии, либо при увеличении количества сеансов ГБО [20].

Поскольку активность СОД и каталазы находится в прямой зависимости от концентрации перекиси водорода и О₂^- [17, 19], то их динамические изменения на применяемый нами курс ГБО и поведение в ПГП следует рассматривать как естественную реакцию здоровой клетки на соответствующее гипероксическое воздействие, а не как результат токсического действия гипероксии. Данное положение следует отнести и к естественным антиоксидантам – мочевине и мочевой кислоте, несмотря на различие в динамике их накопления легочной тканью. Если накопление мочевины не зависело от количества сеансов ГБО и сохранялось к 5-м суткам ПГП, то накопление мочевой кислоты было непосредственно сопряжено с действием ГБО. Такое поведение мочевины и мочевой кислоты при адаптации к гипероксии обусловлено особенностями их метаболизма в организме. Установлено, что легкие не только могут накапливать мочевину, поступающую из крови, но и задерживать выход мочевины, образованной ее клетками в кровь [21]. В тканях млекопитающих имеет место и обратимый переход мочевины из свободного в связанное с белками и липопротеидами состояние, который является одним из защитных механизмов адаптации клетки к гипероксии [7]. Нельзя исключить, что указанные механизмы в той или иной степени детерминируют выявленное нами стойкое накопление мочевины здоровыми легкими как в условиях ГБО, так и на 5-е сутки после ее окончания.

Что касается мочевой кислоты, то увеличение ее содержания в легочной ткани только при гипероксическом воздействии следует связать со способностью мочевой кислоты ингибировать гидроксильный радикал и синглетный кислород [22], образование которых в условиях гипероксии повышается [7]. Общеизвестно, что мочевая кислота – это основной продукт катаболизма пуриновых нуклеозидов, входящих в состав нуклеиновых кислот, коферментов и макроэргов. Если учесть, что в условиях гипероксии ускоряется апоптоз «старых» клеток [6], то следует ожидать увеличения в оксигенированном организме содержания пуринов, являющихся субстратами ксантиноксидазы, которая катализирует образование мочевой кислоты [23]. Поскольку данный процесс сопряжен с образованием О₂^- [23], нейтрализуемого СОД [17], то отчасти находит свое объяснение обнаруженное нами увеличение содержания мочевой кислоты и активности СОД в легочной ткани в 1-е сутки после однократного сеанса ГБО (см. табл. 2). Однако нормализация активности СОД в легочной ткани при увеличении количества сеансов ГБО до 5 (4-я серия; табл. 2) при сохранении повышенного содержания в ней мочевой кислоты позволяет считать последние следствием накопления метаболита легочной тканью. Это может достигаться как за счет его повышенного поступления с кровью, так и в результате снижения инкреции в кровоток.

Заключение. Проведенные исследования показали, что 5-дневный курс ГБО в терапевтическом режиме 2 ата, 50 мин, 1 сеанс в сутки не вызывает накопления в легочной ткани внеэритроцитарного гемоглобина, являющегося катализатором образования кислородных радикалов, и не приводит к неконтролируемому образованию в ней МДА. Адаптируясь к данному гипероксическому воздействию, легкие здорового организма отвечают мобилизацией ферментного и неферментного звеньев антиоксидантной защиты.

Это проявляется стимуляцией активности СОД и каталазы, которые не нарастают при увеличении количества сеансов ГБО от одного до пяти, но оказываются способными демонстрировать отсроченную активность на 5-е сутки после прекращения гипероксического воздействия.

Проявляется накоплением мочевой кислоты легочной тканью как непосредственный ответом на сверхнасыщение организма кислородом и накопление мочевины, которое сохраняется в ПГП независимо от количества сеансов ГБО. Выявленные изменения следует рассматривать как проявление естественной реакции ПОЛ и антиоксидантной системы легких здорового организма на сверхнасыщение кислородом, проводимое в терапевтическом «мягком» режиме: 2 ата, 50 мин.

Вклад авторов. Все авторы в равной степени участвовали в разработке концепции статьи, получении и анализе фактических данных, написании и редактировании текста статьи, проверке и утверждении текста статьи.

Наибольший вклад распределен следующим образом: вклад в концепцию и план исследования — П.Н. Савилов. Вклад в сбор данных — П.Н. Савилов. Вклад в анализ данных и выводы — Н.В. Яковлев. Вклад в подготовку рукописи — П.Н. Савилов, Н.В. Яковлев.

Author contribution. All authors according to the ICMJE criteria participated in the development of the concept of the article, obtaining and analyzing factual data, writing and editing the text of the article, checking and approving the text of the article.

Special contribution: PNS contribution to the concept and plan of the study. PNS contribution to data collection. NVYa contribution to data analysis and conclusions. PNS, NVYa contribution to the preparation of the manuscript.

Потенциальный конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Disclosure. The authors declare that they have no competing interests.

Соответствие принципам этики. Исследование было одобрено на заседании комиссии по биоэтике, утвержденной приказом ректора Воронежской государственной медицинской академии им. Н.Н. Бурденко № 303 от 04.10.2006 г. Протокол заседания № 5 от 15.05.2008. Исследования на животных проводились в соответствии с требованиями Международной декларации о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей.

Adherence to ethical standards. The study was approved at the meeting of the Bioethics Commission approved by the order of the Rector of the Burdenko State State Medical University No. 303 dated 04.10.2006. Minutes of the meeting No. 5 dated 15.05.2008. Animal studies were conducted in accordance with the requirements of the International Declaration on the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes.

Финансирование. Исследование не имеет финансовой поддержки.

Funding. The study was carried out without additional funding.

About the authors

Nikolay V. Yakovlev

Voronezh State Medical University named after N.N. Burdenko; Petropavlovsk District Hospital

Email: nick74@rembler.ru
ORCID iD: 0000-0002-1854-4925
SPIN-code: 7753-3810

Cand. of Sci. (Med.), general practitioner

Russian Federation, Voronezh; Voronezh region, Petropavlovsk district, Petropavlovsk village

Pavel N. Savilov

Voronezh State Medical University named after N.N. Burdenko; Tambov Central District Hospital

Author for correspondence.
Email: p_savilov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0506-8939
SPIN-code: 2394-0924

Dr. of Sci. (Med.), Professor, anesthesiologist-resuscitator

Russian Federation, Voronezh; Tambov region, Tambov district, Pokrovo-Prigorodnoye village

References

Supplementary files